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背景
His标签（Histidine tag, 多组氨酸标签）是一种常用的蛋白标签，在生物化学和分子生物学中用于蛋白质的表达、纯化和检测。它由一段由6-10个组氨酸残基组成的短肽标签构成（常见的为6个His残基，即6His，HHHHHH），通过其组氨酸残基上的基团，与金属离子（如镍或钴）形成稳固的金属螯合键，低浓度咪唑或不含咪唑的洗脱缓冲液去除非特异性结合的杂质，高浓度咪唑（如250-500 mM）的洗脱缓冲液竞争性置换His标签与金属离子的结合，从而洗脱收集目的蛋白。
（数据来源 BioRender）
今天这篇案例分享将结合我们实际项目中遇到的常见问题，来分别讲解His标签融合蛋白的设计处理思路。
N端还是C端
当目的蛋白需要保留N端功能（如信号肽、酶活性中心、N端氨基酸修饰等自身因素），这个时候建议将His标签放置于目的蛋白C端；当目的蛋白C端偏功能域区段，则需要考虑将His标签放置于目的蛋白N端；若以上因素均可忽略，则需要考虑标签添加N/C端的暴露性问题（影响后续纯化）。
展开剩余81%（案例一：迈思生物原始项目数据）
如案例一图示目的蛋白C端为主要功能域，选择原核大肠杆菌表达系统重组表达：当His标签放置于C端时，由于整体疏水性及结构折叠的影响，His标签不暴露，挂柱量非常低，调整His标签位置到N端后，虽然整体蛋白挂柱不彻底，但结合洗脱蛋白含量有明显的改善提升。
（案例二：迈思生物原始项目数据）
案例二截断胞外区段1-166aa作为目的蛋白，因为考虑到N端有信号肽，因此将His标签放置于N端时，位于信号肽和目的蛋白中间，但影响了目的蛋白的正常表达；当His标签放置于C端时，由于C端靠近的跨膜区段氨基酸疏水性高，导致标签挂柱受影响，进一步删去近膜部分的氨基酸选择1-159区段作为目的蛋白，His标签放C端，蛋白挂柱及产量均有明显提升（由于蛋白氨基酸位点糖基化的影响，条带偏大且形成拖尾）。
（案例三：迈思生物原始项目数据）
因此在我们进行重组表达设计His标签位置及结果分析过程中，一方面考虑目的蛋白自身序列因素的影响，另一方面当遇到案例三中的结果时候，表达测试目的蛋白表达丰度高，但挂柱效率低，需要考虑His标签位置不暴露的影响。此外，还可以考虑延长His标签长度的方式提高挂柱效率（例如将6His更换为9His、14His等）。
纯化
由于表达宿主内源性蛋白自身的天然组氨酸残基，很容易导致Ni树脂纯化过程中的非特异性结合，造成His标签融合蛋白的洗脱中含有大量非特异性杂蛋白-案例四。
（案例四：迈思生物原始项目数据）
一方面可以通过调整结合时间来减少非特异性蛋白的吸附提高纯度-案例五。如果杂蛋白与目的蛋白大小差异明显，也可以通过选择合适大小超滤管进行滤除回收；
（案例五：迈思生物原始项目数据）
另一方面通过二次纯化进一步去杂蛋白-案例六（需要注意的是二次纯化前需要将样品进行透析去咪唑，以免影响结合）；
（案例六：迈思生物原始项目数据）
另外考虑在Wash洗杂阶段，提高咪唑的浓度梯度（10mM、20mM、50mM、100mM等）确定最佳洗杂浓度，然后在该浓度下大量清洗树脂，或者人为进行变性纯化处理，再透析置换常规buffer复性提升纯化效果-案例七（该方案适合本身蛋白有大量上清表达的情况，且蛋白稳定性较高）。
（案例七：迈思生物原始项目数据）
包涵体
同时由于His小标签对于疏水性偏高的氨基酸亲水性调节有限，因此也会常常遇到融合蛋白大量以包涵体形式存在或者不表达，难以通过一次纯化获得可溶性上清蛋白。
（案例八：迈思生物原始项目数据）
为了避免后续变性纯化及不可预估的复性操作带来周期和成本增加，可以考虑及时调整更换促溶标签+His双标签的设计，在前期去提升重组蛋白可溶及大量表达，增加后续放大得率、缩减成本-案例九&十。或者考虑在标签和目的蛋白之间添加酶切位点，后期通过酶切的方式去除促溶标签或者纯化标签，这种方案通常也会对操作有要求，蛋白损耗较大，需要多因素综合考量。
（案例九：迈思生物原始项目数据）
（案例十：迈思生物原始项目数据）
小结
目前His标签融合蛋白表达纯化过程中我们通常面临的问题主要包括：①融合蛋白蛋白表达量低或无表达；②纯化后蛋白产量低、纯度低等；③融合蛋白溶解性差，形成包涵体。我们通过优化表达条件、纯化参数和His标签设计，大多数问题是可以得到有效解决。若有其他相关问题，欢迎和我们联系沟通交流。
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